Research Fields of Prof. Dr. Birgit Classen

 

Kontakt: Prof. Dr. Birgit Classen

Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) aus Arzneipflanzen und Getreide sowie pflanzlichen Zellkulturen

       
 
AGPs sind Glykoproteine bzw. Proteoglykane, die in der pflanzlichen Zellwand vorkommen. Für einige wurde gezeigt, dass sie über einen GPI-Anker in der Plasmamembran verankert sind. Auch aus Gummen und Schleimen sowie aus pflanzlichen Zellkulturen bzw. deren Nährmedien sind sie bereits isoliert worden. In vielerlei Hinsicht handelt es sich um äußerst interessante Moleküle.
       
 
Echinacea purpurea L. Moench
 
Kalluskultur von Echinacea purpurea
 
Echinacea purpurea L. Moench
 
Kalluskultur von Echinacea purpurea
       
 

Isolierung

Als Ausgangsmaterial verwenden wir verschiedene Arzneipflanzen, die im Rahmen der Phytotherapie zur Immunstimulation eingesetzt werden (Echinacea sp., Baptisia tinctoria, Viscum album). Weiterhin gewinnen wir AGPs aus verschiedenen Getreidearten (Avena sativa, Secale cereale, Triticum aestivum) sowie auf biotechnologischem Weg aus pflanzlichen Zellkulturen. Suspensionskulturen bieten die Möglichkeit, AGPs unabhängig von Umwelteinflüssen in grosser Menge unter konstanten Bedingungen zu produzieren. Da sie ins Kulturmedium sezerniert werden, können sie relativ einfach gewonnen werden.

Eine Isolierung reiner AGPs ist vor allem durch den Einsatz einer spezifischen Fällungsreaktion möglich. Das sog. Yariv´s Reagenz, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wird, reagiert Antigen-Antikörper-ähnlich mit AGPs und ermöglicht daher eine sehr gute Aufreinigung dieser Makromoleküle.

       
 
Yariv´s Reagenz
 

 

Yariv´s Reagenz
 
 

Struktur

AGPs bestehen aus einem kleinen Protein- (ca. 10 %) und einem grossen Polysaccharidanteil (ca. 90 %). Charakteristische Zucker sind Galaktose und Arabinose sowie weitere Monosaccharide (z.B. Glucuronsäure, Rhamnose) in geringeren Mengen. Der Proteinteil zeichnet sich meist durch einen hohen Gehalt an Hydroxyprolin aus, und für einige AGPs wurde bereits gezeigt, dass das Protein über Verknüpfung zwischen Hydroxyprolin und Galaktose oder auch Arabinose mit vielen Kohlenhydrateinheiten verknüpft sein kann.

Projekte unserer Arbeitsgruppe:

  • Molekulargewichtsbestimmung von AGPs mittels GPC und LLS-Detektion.
  • Strukturaufklärung der Polysaccharideinheiten von AGPs mittels analytischer Verfahren (Partialhydrolysen, Methylierungsanalyse, GLC-MS, NMR).
  • Produktion poly- und monoklonaler Antikörper gegen AGPs, Identifizierung der Epitope mittels ELISA und damit weitere strukturelle Charakterisierung der AGPs.
  • Sequenzierung des Proteinanteils, Aufklärung der Bindungstypen zwischen Protein- und Polysaccharidteil.
  • In Kombination mit immunmodulatorischen Aktivitäten (s.u.) Erarbeitung von Struktur- Wirkungsbeziehungen.
       
 
Zusammensetzung des AGPs aus dem Press-Saft von Echinacea purpurea
 
Zusammensetzung des AGPs aus dem Press-Saft von Echinacea purpurea
   
 
Vereinfachtes Strukturmodell für ein Arabinogalaktan (AG)-Protein
 

Vereinfachtes Strukturmodell für ein Arabinogalaktan (AG)-Protein

       
 

Biologische Funktionen

Für AGPs konnte gezeigt werden, dass sie z. T. Einfluss auf die Zelldifferenzierung haben sowie an Vorgängen wie Zellstreckung oder Zellproliferation beteiligt sein können. In Zellkulturen können sie die Bildung somatischer Embryonen fördern. Erste Hinweise auf eine Beteiligung an Abwehrmechanismen gegen Pathogene bestehen.

Projekte unserer Arbeitsgruppe:

  • Nachweis biologischer Funktionen von AGPs in Zellkulturen. Durch Nutzung von Yariv´s Reagenz, welches dem Kulturmedium zugesetzt wird, können AGPs spezifisch blockiert und die Auswirkungen auf die kultivierten Zellen beobachtet werden.
  • Untersuchung der Bedeutung von AGPs bei Abwehrreaktionen gegen Pilzinfektionen (Infektion von Getreide mit Fusarium-Arten).
       
 

Mikroskopische Detektion von AGPs mit Hilfe von Antikörpern

Die in der Arbeitsgruppe vorhandenen poly- und monoklonalen Antikörper, die gegen ein AGP aus dem Presssaft von Echinacea purpurea generiert wurden, können auch zum mikroskopischen Nachweis von AGPs eingesetzt werden. Für die lichtmikroskopische Detektion wird dabei mit Fluoreszenz-, für die elektronenmikroskopische Detektion mit Goldmarkierung gearbeitet.

Projekte unserer Arbeitsgruppe:

  • Lokalisation von AGPs am Pflanzenschnitt.
  • Auffinden AGP-reicher Entwicklungsstadien von Pflanzen und damit Bestimmung eines günstigsten Erntezeitpunkts für AGP-reiches Pflanzenmaterial.
  • Im Getreide soll nach Infektion mit Rostpilzen eine mögliche Beteiligung von AGPs an Abwehrreaktionen untersucht werden (s.a. Biologische Funktionen).
       
 
Fluoreszenzmarkierung der AGPs im Blattstiel von Echinacea purpurea
 

Fluoreszenzmarkierung der AGPs im Blattstiel von Echinacea purpurea

       
 

Immunmodulatorische Aktivitäten

Phytopharmaka zur Immunstimulation besitzen grosse Bedeutung im Rahmen der Selbstmedikation. Auf der Grundlage einer rationalen Phytotherapie beschäftigt sich die Wissenschaft seit vielen Jahren mit der Suche nach potentiellen Wirkstoffen solcher Zubereitungen. Für Echinacea-haltige Präparate scheinen vier Stoffgruppen als Wirkprinzipien in Frage zu kommen: Kaffeesäurederivate, Alkamide, Polysaccharide und Glykoproteine, insbesondere Arabinogalaktan-Proteine. Als Interaktionsbereich der hochmolekularen AGPs mit dem menschlichen Immunsystem könnten die sog. Peyer´schen Plaques im Dünndarm in Frage kommen.

Projekte unserer Arbeitsgruppe:

  • Aufreinigung der AGPs über Endotrap (zur Entfernung möglicher LPS-Kontaminationen).
  • In-vitro-Testungen von AGPs auf immunmodulatorische Wirksamkeit, u.a. Einfluss auf das Komplementsystem und die Zytokinproduktion, Bindungsfähigkeit von AGPs an humane Leukozyten, Testung von Toll-like-Rezeptoren auf Bindungskapazitäten für AGPs.
  • Präparation der Peyer´schen Plaques aus dem Dünndarm der Ratte und mikroskopischer Nachweis der Bindung von AGPs an die M-Zellen im Bereich der Peyer´scher Plaques.
 
Nachweis der Bindung eines AGPs an humane Leukozyten
 
Nachweis der Bindung eines AGPs an humane Leukozyten
(Messung der Fluoreszenzintensität am Durchflusszytometer)
       
 

Kooperationen:

Inland:

  • Prof. Dr. A. Bufe, Bochum
  • Prof. Dr. I. Merfort, Freiburg
  • Prof. Dr. A. Ulmer, Borstel
  • Dr. I. Zündorf, Frankfurt

Ausland:

  • Prof. A. Bacic, Australien
  • Dr. H. Ichinose, Japan
  • Dr. A. Imberty, Frankreich
  • Dr. R. Kramer, Schweiz
  • Dr. I. Sims, Neeseeland
  • Prof. Dr. B. Smestad-Paulsen, Norwegen
 

Mitarbeiter/innen:

D. Bartels

 

Research Fields of Dr. Esther Marie Heise

 

 

 

 

 

 

Kontakt: Dr. Esther Marie Heise

Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) aus Getreide – Struktur und Lokalisierung

 
 

AGPs gehören zu den pflanzlichen Hydroxyprolin-reichen Glykoproteinen und sitzen im Zellwandbereich pflanzlicher Zellen. Für einige AGPs wurde bereits gezeigt, dass sie über einen GPI-Anker mit der Plasmamembran der Zelle verbunden sein können. Sie spielen eine Rolle im Wachstum und in der Differenzierung der pflanzlichen Zelle, die genaue Funktion der AGPs innerhalb dieser Prozesse ist jedoch noch nicht genau geklärt. Eine Hypothese besagt, dass die AGPs im Prozess des Zellwandaufbaus die geordnete Verbindung zwischen dem Mikrotubuliapparat im Innern der Zelle und dem Ablagern der Cellulosefibrillen im Zellwandbereich mitsteuern. Eine andere Hypothese stellt uronsäurehaltige AGPs als Calciumionen-Kondensatoren dar, die bei Protonenüberschuss Ca 2+ freigeben und somit für einen verstärkten Zellwandmaterialaufbau sorgen.

Isolierung von AGPs

Als Ausgangsmaterial werden die zum einen die Früchte verschiedener Getreidearten genutzt ( Avena sativa L., Secale cereale L., Triticum aestivum L. .), zum anderen auch Haferstroh und Kallus- und Suspensionskulturen aus Hafer. Die AGPs werden über eine spezifische Fällungsreaktion mit Yariv-Reagenz, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wird, isoliert.

Strukturanalytik

Die 80-120 kDa schweren Getreide-AGPs bestehen aus einem kleinen Proteinanteil, der nicht mehr als 8% (m/m) des gesamten Moleküls ausmacht, und einem größeren Kohlenhydratanteil. Dieser ist über Hydroxyprolin O-glykosidisch ans Protein geknüpft und besteht aus mehreren komplex gebauten Einheiten. Prinzipiell bestehen diese Einheiten aus verzweigten Galaktoseketten, die von Arabinoseeinheiten terminiert werden. Interessanterweise lassen sich keine Uronsäuren in den AGPs der Getreidefrüchte, wohl aber in den AGPs des Haferstrohs wiederfinden.

 

 

Modell des AGPs aus Weizenfrüchten nach Göllner et al. 2010

 

 

Methodik:

  • Molekulargewichtsbestimmung mittels GPC und LLS-Detektion
  • Strukturaufklärung der Kohlenhydrateinheiten (Bestimmung der Zuckerbausteine, Bindungstypanalyse, Spezifische Degradation der Glykoproteine) mittels GC-FID, GC-MS, NMR, HPTLC
  • Immundetektion der Glykoproteine mittels poly- und monoklonaler Antikörper
  • Proteinanalytik nach vorhergehender Deglykosylierung des Glykoproteins

 

Lokalisierung von AGPs mittels Fluoreszenzmikroskopie

Zur mikroskopischen Lokalisierung der AGPs z.B. in den pflanzlichen Geweben selbst, können die AGPs entweder über gegen sie gerichtete Antikörper detektiert werden, oder aber indirekt über Yariv Reagenz, welches an die AGPs bindet und dann selbst wiederum über Antikörper detektiert werden kann.

 

 

 

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen nach Immunmarkierung von AGPs über Yariv-Reagenz in Querschnitten der Hafer-Wurzel

 

  Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) und ihr Einfluss aus die Transformation pflanzlicher Zellen mit Agrobacterium tumefaciens
 

Zum Transfer fremder DNA in pflanzliche Zellen kann das Bakterium Agrobacterium tumefaciens genutzt werden. Interessanterweise sinken die Transformationsrate sowie das Regenerationspotential beim Transformationsversuch rapide ab, wenn AGPs durch Yariv Reagenz blockiert werden. Im Fokus der Arbeit steht hier die Ermittlung der Interaktion der AGPs mit dem Bakterium.

  Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) als Immunmodulatoren
  Für AGPs aus Arzneipflanzen (z.B. dem roten Sonnenhut) konnten bereits Interaktionen mit dem humanen Immunsystem gezeigt werden. Sie haben einen Einfluss auf das Komplementsystem und die Zytokinproduktion und weisen eine Bindungsfähigkeit an Leukozyten auf. Diese in vitro-Ergebnisse werden ausgebaut:

Über einen mikroskopischen Nachweis der AGPs mit M-Zellen von Peyerschen Plaques, zugehörig dem Immunsystem des Dünndarms, sollen AGPs als oral verfügbare Immunmodulatoren plausibilisiert werden.

Als Rezeptoren für AGPs kommen wahrscheinlich nur Rezeptoren in Frage, welche in der Lage sind, Glykanstrukturen zu erkennen. Hier gibt es eine Vielzahl von potentiellen Kandidaten, die - wenn möglich - in den biologischen Systemen selbst zunächst auf ihre Bindungsfähigkeit und im Anschluss auch auf ihre Wirkung getestet werden sollen.