Arabinogalaktan-Proteine (AGPs)

 

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Arabinogalaktan-Proteine (AGPs):

Signalmoleküle der pflanzlichen Zellwand

 

AGPs sind Glykoproteine der pflanzlichen Zellwand, für die z.T. eine Verankerung in der Plasmamembran über einen GPI-Anker gezeigt wurde. Sie bestehen aus einem kleinen Protein- (ca. 10 %) und einem grossen Polysaccharidanteil (ca. 90 %). Charakteristische Zucker sind Galaktose und Arabinose sowie weitere Monosaccharide (z.B. Glucuronsäure, Rhamnose) in geringeren Mengen. Der Proteinteil zeichnet sich meist durch einen hohen Gehalt an Hydroxyprolin aus, und u.a. auch in unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäure O-glykosidisch mit vielen Kohlenhydrateinheiten verknüpft sein kann. Interessanterweise weisen AGPs aus Echinacea purpurea Aminosäuresequenzen auf, bei denen Hydroxyprolin blockweise vorkommt; ein Merkmal, welches für AGPs eher untypisch, dafür aber typisch für andere Glykoproteine der Zellwand (Extensine) ist. Im Folgenden werden unsere Forschungsinteressen näher ausgeführt (siehe auch Publikationsverzeichnis).

1. Isolierung der AGPs

2. Strukturaufklärung von AGPs / Polysacchariden

3. Evolution der pflanzlichen Zellwand

4. Biologische Funktionen von Arabinogalaktan-Proteinen in der Pflanze

5. Biologische Aktivitäten von Arabinogalaktan-Proteinen und partiell

           degradierten Galaktanen im Menschen

         

Mitarbeiter/innen:

Doktoranden: Alexander Baumann, Lukas Pfeifer, Jon Utermöhlen
Master: Ole Franck, Kathrin Happ

 

Kooperationen

 

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in progress

1. Isolierung der AGPs

 

Echinacea purpurea L. Moench © Andreas Bossy            Kalluskultur von E. purpurea

Echinacea purpurea L. Moench                       Kalluskultur von E. purpurea
© Andreas Bossy

 

Als Ausgangsmaterial verwenden wir verschiedene Arzneipflanzen, die im Rahmen der Phytotherapie zur Immunstimulation eingesetzt werden (z.B. Echinacea sp., Baptisia tinctoria, Viscum album). Weiterhin gewinnen wir AGPs aus verschiedenen Getreidearten (Avena sativa, Secale cereale, Triticum aestivum) sowie auf biotechnologischem Weg aus pflanzlichen Zellkulturen. Suspensionskulturen bieten die Möglichkeit, AGPs unabhängig von Umwelteinflüssen in grosser Menge unter konstanten Bedingungen zu produzieren. Da sie ins Kulturmedium sezerniert werden, können sie relativ einfach gewonnen werden. In letzter Zeit suchen wir verstärkt auch nach AGPs in ursprünglichen Landpflanzen (Moose, Bärlappe, Farne), in Algen sowie in marinen Angiospermen.

Eine Isolierung reiner AGPs ist vor allem durch den Einsatz einer spezifischen Fällungsreaktion möglich. Das sog. Yariv´s Reagenz, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wird, reagiert Antigen-Antikörper-ähnlich mit AGPs und ermöglicht daher eine sehr gute Aufreinigung dieser Makromoleküle.

 

Struktur des β-Glucosyl Yariv Reagenz (Glc = β-Glc)

Struktur des β-Glucosyl Yariv Reagenz (Glc = β-Glc)

 

 

2. Strukturaufklärung

 

Zu unseren Expertisen gehört die Strukturaufklärung von AGPs und anderen pflanzlichen Polysacchariden. Dazu werden u.a. die folgenden Methoden genutzt:

  • Molekulargewichtsbestimmung mittels GPC und LLS-Detektion
  • Strukturaufklärung von Polysacchariden mittels analytischer Verfahren (Partialhydrolysen, Methylierungsanalyse, GLC-MS, NMR)
  • Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung von AGPs
  • Photometrische Quantifizierung von Hydroxyprolin
  • In Kombination mit immunmodulierenden Aktivitäten (s.u.) Erarbeitung von Struktur- Wirkungsbeziehungen

 

vereinfachtes Strukturmodell für ein Arabinogalaktan-Protein

Vereinfachtes Strukturmodell für ein Arabinogalaktan-Protein

 

Strukturvorschlag für den Arabinogalaktan-Teil des AGPs aus E. purpurea

Strukturvorschlag für den Arabinogalaktan-Teil des AGPs aus E. purpurea

 
Publikationsauswahl
 
Göllner EM, Ichinose H, Kaneko S, Blaschek W and Classen B: An arabinogalactan-protein from whole grain of Avena sativa L. belongs to the wattle-blossom type of arabinogalactan-proteins. J Cereal Science (2011), 53: 244-249
 
Göllner EM, Utermöhlen J, Kramer R and Classen B: Structure of arabinogalactan from Larix laricina and its reactivity with antibodies directed against type-II-arabinogalactans. Carbohydr Pol (2011) 86(4): 1739-1744.
 
Göllner EM, Blaschek W, Classen B: Structural investigations on arabinogalactan-protein from wheat, isolated with Yariv reagent. J Agr Food Chem (2010) 58(6): 3621-3626.
 
Classen B: Characterization of an arabinogalactan-protein from suspension culture of Echinacea purpurea. Plant Cell Tiss Org Cult (2007) 88: 267-275.
 
Thude S, Classen B: High molecular weight constituents from roots of Echinacea pallida: An arabinogalactan-protein and an arabinan. Phytochemistry (2005) 66: 1026-1032.
 
Classen B, Mau SL, Bacic A: The arabinogalactan-proteins from pressed juice of Echinacea purpurea belong to the “hybrid” class of hydroxyproline-rich glycoproteins. Planta Med (2005) 71:59-66.
 
Classen B, Witthohn K, Blaschek W: Characterization of an arabinogalactan-protein isolated from pressed juice of Echinacea purpurea by precipitation with the ß-glucosyl Yariv reagent. Carbohydr Res (2000) 327: 497-504.

 

 

3. Evolution der Zellwand

 

Es wird angenommen, dass AGPs in allen höheren Landpflanzen zu finden sind, was unsere eigenen Untersuchungen an zahlreichen Arten aus verschiedenen Familien bestätigen. Neben den typischen gemeinsamen Eigenschaften weisen verschiedene AGPs jedoch feinstrukturelle Unterschiede auf, sowohl in Hinblick auf ihr Proteinrückgrat als auch in der Zusammensetzung ihres Kohlenhydratanteils. Im Holz von Gymnospermen kommen häufig große Mengen von reinen Arabinogalaktanen ohne Proteinanteil vor; daneben scheinen teilweise aber auch AGPs vorhanden zu sein. Es gibt bisher nur wenige Arbeiten zum Vorkommen und zur Struktur von AGPs in Sporenpflanzen (Farne, Bärlappe, Moose, Algen), die auch Aufschluss darüber geben könnten, wann AGPs in der Evolution entstanden sind. In 2017 haben wir strukturelle Besonderheiten von AGPs aus Moosen und Farnen nachgewiesen, die in AGPs von Angiospermen nicht zu finden sind. Zu erwähnen ist hier insbesondere das ungewöhnliche Monosaccharid 3-O-Methylrhamnose als Bestandteil von Moos- und Farn-AGPs sowie große Mengen terminaler pyranosidischer Arabinose im AGP von Lycopodium. Aktuell werden diese Arbeiten auf die den Landpflanzen phylogenetisch am nächsten stehenden Algen (Zygnematophyceae, Charophyceae) ausgeweitet, um dem evolutionären Ursprung der AGPs näher zu kommen und evt. auch Rückschlüsse auf unterschiedliche Funktionen von AGPs in den verschiedenen Pflanzengruppen ziehen zu können. Aktuell untersuchen wir auch die Zellwände von marinen Angiospermen (z.B. Zostera, Enhalus) und deren Verwandten im Süßwasser (z.B. Lemna), um Aussagen bzgl. der Änderung der Zellwandzusammensetzung von Angiospermen als Anpassung an das Leben im Salz- und Süßwasser tätigen zu können.

 

GLC of neutral monosaccharides (alditol aceatates) from Sphagnum AGP

GLC of neutral monosaccharides (alditol aceatates) from Sphagnum AGP

 

Publikationsauswahl

Bartels D, Classen B: Structural investigations on arabinogalactan-proteins from a lycophyte and different monilophytes (ferns) in the evolutionary context. Carbohydr Pol (2017) 172: 342-351.
 
Bartels D, Baumann A, Maeder M, Geske T, Heise EM, v Schwartzenberg K, Classen B: Evolution of plant cell wall: Arabinogalactan-proteins from three moss genera show structural differences compared to seed plants. Carbohydr Pol (2017) 163: 227–235.

 

 

4. Funktionen von AGPs in planta

 

Für einige AGPs konnte gezeigt werden, dass sie Einfluss auf die Zelldifferenzierung haben sowie an Vorgängen wie Zellstreckung, Zellproliferation oder dem programmierten Zelltod beteiligt sein können. Ein erster Schritt zu Rückschlüssen auf mögliche Funktionen ist die Lokalisation von AGPs in der Pflanze. Dazu nutzen wir Antikörper und detektieren die AGPs mit Hilfe von Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie.

Folgende Antikörper stehen uns zur Verfügung:

  • Polyklonale Antikörper gegen Echinacea-AGP (Kaninchen)
  • Monoklonale Antikörper (KM = Kiel Monoclonal) gegen Echinacea AGP (Maus)
  • Polyklonale Antikörper gegen β-Glc Yariv Reagenz (KLH gekoppelt, Kaninchen)

 

Fortlaufend arbeiten wir an der Epitopcharakterisierung der AGP-Antikörper. Für KM 1 konnte in 2017 das notwendige Oligosaccharidepitop für KM 1 sehr gut charakterisiert werden. Diese Arbeiten erfolgten durch Dr. Fabian Pfrengle, Max Planck Institute of Colloids and Interfaces, Potsdam) unter Einsatz zahlreicher synthetisch hergestellter Oligosaccharide.

 

 Xylemdifferenzierung

Wir konnten für Echinacea purpurea zeigen, dass AGPs in Wurzeln, Stängeln und Blattstielen bevorzugt in Zellwänden von Tracheen und Tracheiden vorkommen. Die Änderung der Lokalisation der AGPs während der Entwicklung der Tracheen (siehe Abb. B und C) unterstützt die Hypothese anderer Autoren, dass AGPs an der Differenzierung des Xylems beteiligt sind. Als erste Arbeitsgruppe konnten wir zusätzlich zeigen, dass AGPs gehäuft auch im Bereich der Tüpfelkanäle vorkommen, die benachbarte Tracheen / Tracheiden verbinden, so dass AGPs vermutlich auch eine Funktion bei der Entstehung von Tüpfelkanälen einnehmen.

 Immunfluoreszenz von AGPs im Blattstiel von Echinacea purpurea.Immunfluoreszenz von AGPs im Blattstiel von Echinacea purpurea. II 

Immunfluoreszenz von AGPs im Blattstiel von Echinacea purpurea.

A Querschnitt; Immunfluoreszenz der AGPs vor allem im Xylem der Leitbündel.

B Differenzierung des Xylems im offen kollateralen Leitbündel.

1: Junges, sich differenzierendes Gefäß mit Sekundärwand und AGPs im Zytoplasma.

2: Vollständig ausdifferenziertes Gefäß des Metaxylems ohne Zytoplasma, aber mit der typischen Zellwandverdickung mit Tüpfelkanälen; AGPs nun in der Zellwand.

3: Älteres Gefäß, wahrscheinlich aus dem Protoxylem mit großen AGP-Ablagerungen im Bereich der Sekundärwand.

C Querschnitt durch 3 junge, neu entstehende Gefäße in der Nähe des Kambiums. AGPs befinden sich im Zytoplasma, nicht im Zellwandbereich.


 Immunlokalisierung von AGPs im Xylem von E. purpurea.

Links und Mitte Querschnitt durch das Xylem des Stängels.

Immunfluoreszenz der AGPs vor allem am inneren Saum der Zellwand sowie im Bereich der Tüpfelkanäle.

Rechts Längsschnitt eines xylematischen Gefäßes des Blattstiels.

Immunfluoreszenz der AGPs in der Zellwand um die Tüpfelkanäle herum.

 

Publikationsauswahl

Göllner EM, Gramann JC, Classen B: Antibodies against Yariv´s reagent for immunolocalization of arabinogalactan-proteins in aerial parts of Echinacea purpurea. Planta Med (2013) 79(2): 175-80.
 
Bossy A, Blaschek W, Classen B: Characterization and immunolocalization of arabinogalactan-proteins in roots of Echinacea purpurea. Planta Med (2009) 75: 1526-1533.

 

Somatische Embryogenese

In Zellkulturen können AGPs die Bildung somatischer Embryonen fördern. Für die Arzneipflanze Pelargonium sidoides, deren Wurzeln Ausgangsmaterial für pflanzliche Arzneistoffe zum Einsatz bei akuter Bronchitis sind und die auch heute noch viel aus Wildsammlungen in Südafrika stammen, haben wir eine neue Methode zur Vermehrung mittels somatischer Embryogenese entwickelt. Der Einfluss verschiedener Phytohormone zur Optimierung des Verfahrens wurde untersucht, wobei sich Thidiazuron als am besten geeignet erwies. Besonders interessant ist der Einfluss von AGPs auf diesen Prozess. Mit Hilfe von extern zugeführten AGPs aus P. sidoides oder auch aus Zellkulturen der Pflanze kann die Anzahl der gebildeten Embryonen und Jungpflanzen deutlich gesteigert werden. Dies wurde in einem Versuchsansatz mit über 1000 Pflanzen statistisch abgesichert.

Entwicklung somatischer Embryonen an Explantaten des Blütenstandstängels von P. sidoidesEntwicklung somatischer Embryonen an Explantaten des Blütenstandstängels von P. sidoides II

Entwicklung somatischer Embryonen an Explantaten des Blütenstandstängels von P. sidoides

Entwicklung der durch somatische Embryogenese entstandenen Jungpflanzen im Gewächshaus

Entwicklung der durch somatische Embryogenese entstandenen Jungpflanzen im Gewächshaus

 

Publikationsauswahl

Duchow S, Dahlke RI, Geske T, Blaschek W, Classen B: Arabinogalactan-proteins stimulate somatic embryogenesis and plant propagation of Pelargonium sidoides. Carbohydr Pol (2016) 152: 149-155.
 
Duchow S, Blaschek W, Classen B: Reproduction of the medicinal plant Pelargonium sidoides via somatic embryogenesis. Planta Med (2015) 81: 1169-1174.

 

 

Salztoleranz

Arbeiten zur Funktion von AGPs und/oder Pektinen in Mechanismen der Salztoleranz wurden in der Vergangenheit bereits durchgeführt und werden aktuell an der schleimproduzierenden Pflanze Kosteletzkya virginica (Malvaceae) weitergeführt (Kooperation mit Dr. S. Lutts, Pflanzenphysiologie, Universität Louvain, Belgien).

 

Publikation

Ghanem ME, Han RM, Classen B, Quetin-Leclerq J, Mahy G, Ruan CJ, Qin P, Perez-Alfocea F, Lutts S: Mucilage and Polysaccharides in the Halophyte Plant Species Kosteletzkya virginica (L.) Presl.: Localization and Composition in relation to salt stress. J Plant Physiol (2010) 167: 382-392.
 

 

Pathogenabwehr

In der Literatur finden sich ferner Hinweise auf eine Beteiligung von HPRGs (= Hydroxyprolin-reiche-Glykoproteine) der pflanzlichen Zellwand im Rahmen der Pathogenabwehr. In ersten Versuchen konnten wir zeigen, dass bei Nematodenbefall von Getreide der Gehalt an Hydroxyprolin in den Getreidezellwänden ansteigt, was eine Beteiligung von HRGPs, zu denen AGPs und Extensine gehören, nahelegt. Im Rahmen eines BMBF-Projektes  („NEMARES“, Leiter Prof. Jung, Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung, CAU Kiel) wird dieser Mechanismus momentan weiter untersucht.

 

 

5. Biologische Aktivitäten von AGPs

 

Phytopharmaka zur Immunstimulation besitzen große Bedeutung im Rahmen der Selbstmedikation. Auf der Grundlage einer rationalen Phytotherapie beschäftigt sich die Wissenschaft seit vielen Jahren mit der Suche nach potentiellen Wirkstoffen solcher Zubereitungen. Für Echinacea-haltige Präparate scheinen vor allem zwei Stoffgruppen als Wirkprinzipien in Frage zu kommen: niedermolekulare Alkamide und hochmolekulare Polysaccharide bzw. Glykoproteine, insbesondere Arabinogalaktan-Proteine. Immunmodulatorische Wirkungen können zunächst in vitro nachgewiesen werden, z.B. können wir zeigen, dass AGPs an die Oberfläche von humanen Leukozyten binden und die Ausschüttung von Cytokinen aus murinen Makrophagen stimulieren. Untersuchungen von Frau Prof. Alban (Pharmazeutische Biologie, Universität Kiel) zeigen eine Aktivierung des humanen Komplementsystems durch AGPs aus Echinacea.

Nachweis der Bindung eines AGPs an humane Leukozyten

Nachweis der Bindung eines AGPs an humane Leukozyten

(Messung der Fluoreszenzintensität mittels FACS)

 

Publikationsauswahl

Peters M, Guidato PM, Peters K, Megger DA, Sitek B, Classen B , Heise EM, Bufe A: Allergy-protective arabinogalactan modulates human dendritic cells via c-type-lectins and inhibition of NFκB. J Immunology (2015) 196(4):1626-35.

Classen B, Thude S, Blaschek W, Wack M, Bodinet C: Immunomodulatory effects of arabinogalactan-proteins from Baptisia and Echinacea. Phytomedicine (2006) 13: 688-694.

Thude S, Classen B, Blaschek W, Barz D, Thude D: Binding studies of an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea to leucocytes. Phytomedicine (2006) 13: 425-427.

Alban S, Classen B, Brunner G, Blaschek W: Haemolytic complement assay for the differentiation between the complement modulating effects of an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea and heparin. Planta Med (2002) 68: 1118-1124.

 

 

Bezüglich einer potentiellen Immunmodulation stellt sich die Frage, inwieweit AGPs bei oraler Aufnahme überhaupt mit Komponenten des menschlichen Immunsystems interagieren können. Eine Möglichkeit wäre eine Bindung und Aufnahme von AGPs im Bereich der Peyer´schen Plaques im Dünndarm. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz wurde im Rahmen einer Diplomarbeit die Bindung von AGPs an Dome-Epithelien der Peyer´schen Plaques verschiedener Spezies (Maus, Kaninchen, Mensch) untersucht.

Querschnitt des humanen Ileums

Querschnitt des humanen Ileums

Eine weitere Interaktionsmöglichkeit im Bereich der Darmschleimhaut sind die dort vorkommenden Galektine, die als Rezeptoren für pflanzliche Galaktane dienen könnten, da sie eine hohe Affinität zu ß-Galaktoseresten aufweisen. In ersten Versuchen mittels ELISA konnten wir zeigen, dass AGPs an humanes Galectin-3 binden und dass diese Bindungsaffinität bei Partialhydrolyse des AGPs noch steigt. Bei einer solchen Partialhydrolyse, wie sie auch bei der normalen Magenpassage stattfinden könnte, steigt die Menge an terminalen Galaktoseresten und damit vermutlich die Affinität zu Galektin-3. Eine weitere Möglichkeit eines partiellen Abbaus von Polysacchariden aus der Nahrung zu kleineren Galaktanen ist eine enzymatische Hydrolyse mit Hilfe der im Darm vorhandenen Mikroorganismen. Da erste Hinweise bestehen, dass Galektine bei Krebserkrankungen überexprimiert werden, stellt die Blockade von Galektinen ein neues therapeutisches Target dar (Kooperation mit Frau Prof. S. Sebens, Institut für experimentelle Tumorforschung, CAU Kiel). Erste Versuche zeigen, dass eine Zugabe von degradierten pflanzlichen Galaktanen  in Zellkultur die Adhäsion von Pankreaskarzinomzellen, welche an ihrer Oberfläche Galektin-3 exprimieren,  an humane Leberzellen hemmen kann.

 

 

Kooperationen

Kooperationen:

Prof. Dr. E. Beitz, Pharmazeutisches Institut, CAU Kiel

Prof. Dr. C. Jung, Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung, CAU Kiel

Prof. Dr. S. Sebens, Institut für experimentelle Tumorforschung, CAU Kiel

PD Dr. K. von Schwartzenberg, Aquatische Ökophysiologie und Phykologie, Universität Hamburg

Dr. I. Zuendorf, Pharmazeutische Biologie, Universität Frankfurt

Dr. F. Pfrengle, Max Planck Institute of Colloids and Interfaces - Department of Biomolecular Systems, Potsdam

Prof. Dr. S. Lutts, Earth and Life Institute, Katholische Universität Löwen, Belgien

Prof. Dr. B. Smestad-Paulsen, Pharmazeutisches Institut Oslo, Norwegen

Prof. Dr. A. Bacic, La Trobe Institute of Agriculture and Food, La Trobe University, Melbourne, Australien

Echinacea

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Kalluskultur

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Yariv

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AGP wattle-blossom-model

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AGP glycan model

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Chromatogramm

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embryogenesis

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embryos

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green house

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Leitbündel

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Blattstiel

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xylem

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leucocyte

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ileum peyers patches

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